mRNA药物制备的关键技术——切向流过滤的高效应用

mRNA药物作为一种新型的生物制药技术,因其在治疗和预防疾病方面的潜力而受到广泛关注。切向流过滤(TFF)技术高效率、高回收率特点,在mRNA药物制备中作用很大。
 

一、什么是mRNA?

mRNA是细胞中的一种核糖核酸,它携带遗传信息,指导细胞制造特定的蛋白质。在mRNA药物中,人工合成的mRNA被设计用来编码治疗性蛋白质,这些蛋白质可以用于治疗或预防疾病。
 

二、mRNA药物工作原理

  • 编码设计:科学家设计并合成一段特定的mRNA序列,这段序列编码了一种治疗性的蛋白质。
  • 传递进入细胞:为了确保mRNA药物有效进入患者细胞内,需要一种有效的传递系统如脂质纳米颗粒(LNP),对其进行包裹保护,防止mRNA在到达作用部位前被酶解或无法穿透细胞膜。
  • 蛋白质合成:一旦mRNA进入细胞,它就会被细胞的蛋白质合成机制识别,并指导细胞合成所需的治疗性蛋白质。
 

三、TFF技术在mRNA药物制备中的应用

mRNA药物生产工艺步骤
1、mRNA生产工艺步骤
mRNA的生产工艺步骤基本上分为以上三个步骤,质粒DNA原液制备的基础是转录模板的序列设计,制备方法通常采用质粒DNA扩增,也可采用PCR扩增。以DNA扩增为例,通常采用工程菌E.coli发酵来扩增。先进行菌种复苏,质粒DNA的生产经过发酵培养、收获澄清、精制纯化、线性化、分装储存等步骤。mRNA原液制备主要工艺包括将线性化质粒DNA体外转录(IVT)为mRNA,进行化学修饰后分离纯化,纯化后的mRNA原液分装冻存。mRNA制剂的主要工艺包括mRNA-LNP包封制备、纯化、除菌过滤、无菌灌装等。我们本文将重点讨论哪些步骤需要用到TFF工艺,如何选择膜包和中空纤维,具体用到哪些规格等。
2、质粒DNA原液制备
   上游质粒扩增的主要工艺是通过E.coli发酵,培养结束后,需要对菌体进行收集。实验室离心机受限于其操作,难以满足商业化规模化生产,工业上连续流离心机剪切力较高。而中空纤维有开放式的通道,能够处理高固含量、高粘度、剪切敏感的样品,并且具有良好的放大能力。收集采用750kD/100nm的中空纤维膜柱,去除细胞碎片及培养基组分。接下来采用高压均质机破碎、超声裂解、碱裂解进行菌体裂解,通过深层过滤进行澄清。为便于层析纯化,在层析上样前,先采用TFF进行浓缩和换液,以大大减少样品体积,同时去除部分RNA、HCP、HCD等杂质。
   依据质粒DNA分子量大小选用30kD/100kD/300kD,TMP小于0.5bar。然后,通过层析进行精制纯化。经过层析后质粒DNA的纯度已经很高,根据线性化步骤的需要,可以先进行超滤浓缩换液,依据质粒DNA分子量大小选用30kD/100kD/300kD,再采用限制性内切酶完成质粒DNA的线性化。完成线性化后,采用除菌过滤来控制微生物负荷。
   由于质粒DNA为胞内产物,并且生产特定长度和序列的mRNA需要高度纯化且线性化的质粒原料,整个下游纯化过程工艺路线较为复杂,收率不高(30%~40%),这造成行业的质粒生产成本较高,如何优化和改良下游纯化工艺,成为目前质粒DNA制备环节中急需解决的问题。
质粒DNA的线性化
3、mRNA原液制备
体外转录(IVT)和修饰是mRNA原液制备的关键工艺,涉及多个步骤,包括转录、5’端加帽、3’端加Poly(A)尾、去磷酸化等步骤,转录和修饰后,可采用30kD/100kD/300kD的膜包和中空纤维膜柱去除RNA聚合酶、DNA片段、NTPs、加帽酶、dsRNA、抑制剂等杂质,并置换buffer。然后采用亲和层析、尺寸排阻层析、离子对反相层析、离子交换层析等层析工艺进行精制纯化,经过前述超滤、层析等纯化步骤后,mRNA已经达到相当的纯度,再使用30kD/100kD/300kD膜包或中空纤维膜柱调整原液中mRNA浓度并置换buffer。采用除菌过滤来控制微生物负荷进行暂存封装。
体外转录加帽反应策略
4、mRNA制剂制备
   mRNA-LNP包封制备是mRNA制剂制备的关键工艺,除了脂质成分配方外,就是工艺过程的控制了,即如何控制mRNA与脂质成分的接触和相互作用过程,通过微流控技术以形成稳定、均一、收率高的mRNA-LNP复合物。mRNA-LNP溶液通过100kD/300kD TFF技术进行浓缩换液,mRNA-LNP复合物被截留,乙醇、制剂被洗滤。最后除菌过滤采用0.22μm除菌级过滤器冗余设置,截留细菌等微生物污染物。最终,进行无菌灌装。
LNP结构
LNP-mRNA成品的工艺流程

在mRNA技术在传染病疫苗领域获得突破性进展的同时,mRNA技术在其它领域的应用也正在展开。我们期待随着科学的进步和技术的发展,mRNA技术能够获得更为广泛的应用,造福广大病患!

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